不同N-乙酰-5-羟色胺(NAS)给药途径对大鼠视网膜缺

精选论文 2020-06-05 08:08119未知xhm
  摘要:目的 探讨腹腔与尾静脉注射N-乙酰-5-羟色胺(N-acetylserotonin,NAS)两种给药途径对大鼠视网膜缺血-再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)组织病理学、活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达及细胞凋亡的影响。方法 健康无眼疾成年Sprague-Dawley雄性大鼠54只,采用随机数字表法分为正常对照组(n=6)、RIRI腹腔组(n=12)、RIRI静脉组(n=12)、NAS腹腔组(n=12)和NAS静脉组(n=12),后四组采用升高眼压法建立大鼠RIRI模型。NAS腹腔组、NAS静脉组于建模前30 min分别经腹腔、尾静脉注射NAS(10 mg·kg-1),RIRI腹腔组、RIRI静脉组于造模前30 min分别经腹腔、尾静脉注射同等剂量的生理盐水。RIRI后24 h,采用免疫组织化学染色检测各组大鼠视网膜中活性Caspase-3的表达,TUNEL染色检测各组视网膜细胞凋亡情况;RIRI后7 d,HE染色观察各组视网膜组织病理学变化。结果 HE染色结果示,正常对照组大鼠视网膜各层细胞排列整齐、规则;RIRI后7 d,RIRI腹腔组与RIRI静脉组大鼠视网膜细胞排列稀疏、紊乱,形态不规则,视网膜内层厚度变薄;NAS腹腔组视网膜细胞形态较规则,排列较规整;NAS静脉组视网膜各层形态及细胞排列均趋于正常。NAS静脉组视网膜内层厚度[(91.67±1.43)μm]显着高于NAS腹腔组[(87.80±1.33)μm]、RIRI腹腔组[(82.37±1.09)μm]和RIRI静脉组[(82.81±0.90)μm],差异均具有统计学意义(均为P<0.05);且NAS静脉组视网膜神经节细胞数[(616.90±79.51)个·mm-2]显着高于NAS腹腔组[(529.25±92.05)个·mm-2]、RIRI静脉组[(434.42±87.17)个·mm-2]、RIRI腹腔组[(390.72±72.12)个·mm-2],差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。免疫组织化学染色结果发现,RIRI后24 h,NAS静脉组活性Caspase-3阳性细胞数[(145.01±22.54)个·mm-2]少于NAS腹腔组[(221.34±30.84)个·mm-2],差异具有统计学意义(P<0.05),二者活性Caspase-3阳性细胞数均显着少于RIRI静脉组[(380.54±41.25)个·mm-2]和RIRI腹腔组[(387.79±26.72)个·mm-2],差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。TUNEL染色结果示,RIRI后24 h,NAS静脉组TUNEL染色阳性细胞数[(1468.03±128.40)个·mm-2]少于NAS腹腔组[(1968.96±254.98)个·mm-2],差异具有统计学意义(P<0.05),二者TUNEL染色阳性细胞数均显着少于RIRI静脉组[(2122.77±165.76)个·mm-2]和RIRI腹腔组[(2140.53±177.96)个·mm-2],差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。结论 腹腔及静脉注射NAS治疗均可减少视网膜细胞凋亡,从而减轻RIRI大鼠视网膜损伤,且静脉注射给药的疗效优于腹腔给药。
  关键词:N-乙酰-5-羟色胺; 视网膜缺血-再灌注损伤; 活性Caspase-3; 细胞凋亡; 视网膜内层厚度;

  视网膜缺血-再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)可见于多种眼部疾病,如视网膜血管闭塞、糖尿病视网膜病变和青光眼等[1],是目前致盲的主要原因之一。N-乙酰-5-羟色胺(N-acetylserotonin,NAS)属于吲哚类激素,是一种天然存在的化学中间体,是褪黑素的前体物质。有研究表明,NAS对缺血性疾病和神经系统疾病模型均具有神经保护作用[2]。本课题组前期研究亦发现,NAS可通过抑制活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Fas/FasL、Bax蛋白的表达和促进Bcl-2蛋白的表达而减轻RIRI大鼠视网膜细胞的凋亡[3-4],进一步证明NAS对RIRI的神经有保护作用。鉴于不同的给药途径疗效不同,本研究采用升高眼压法建立RIRI模型,探讨腹腔与静脉注射两种不同NAS给药途径对RIRI大鼠视网膜形态结构、活性Caspase-3蛋白表达及细胞凋亡的影响,以期为NAS治疗RIRI的临床最佳给药途径提供理论依据。

  1 材料与方法

  1.1 材料
  1.1.1 实验动物及分组
  健康无眼疾成年Sprague-Dawley雄性大鼠54只,体质量200~250 g。经裂隙灯检查大鼠的眼前节及后节均无异常,随机分为正常对照组(n=6)、RIRI腹腔组(n=12)、RIRI静脉组(n=12)、NAS腹腔组(n=12)和NAS静脉组(n=12)。正常对照组不作处理,后四组建立RIRI模型。NAS腹腔组和NAS静脉组于建模前30 min分别经腹腔、尾静脉按10 mg·kg-1体质量注射NAS,RIRI腹腔组和RIRI静脉组于造模前30 min分别经腹腔、尾静脉注射同等剂量的生理盐水。RIRI腹腔组、RIRI 静脉组、NAS腹腔组及NAS静脉组依据RIRI后时间分为24 h及7 d两个亚组(n=6)。实验动物及实验使用条件均符合《实验动物管理条例》的规定。
  1.1.2 主要试剂及仪器
  NAS(美国Sigma-Aldrich公司),兔抗活性Caspase-3抗体、兔抗二步法试剂盒、DAB显色剂试剂盒、HE染色试剂盒(中国Servicebio公司),TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(美国Roche公司)。电子分析天平(AL-204,美国Mettler Toledo公司),石蜡切片机(Shandon Finesse325,英国珊顿公司),正置荧光显微镜(BX-51,日本Olympus公司)。
  1.2 方法
  1.2.1 RIRI模型制作
  采用前房加压灌注升高眼压法制作RIRI动物模型。100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉,统一选取各组大鼠右眼,复方托吡卡胺散瞳,盐酸奥布卡因表面麻醉,微量注射器自大鼠右眼颞侧角膜缘刺入前房并固定,升高输液瓶高度使眼内形成110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)的眼压,此时可见大鼠前房加深,球结膜苍白,直接检眼镜见眼底视网膜血管白线,血流中断;持续灌注60 min后缓慢降低输液瓶高度至眼平面水平,恢复正常眼压,此时可见大鼠眼球色红,眼底血管清晰,提示RIRI模型建立成功。
  1.2.2 标本的采集及石蜡切片的制作
  分别于RIRI后24 h、7 d,各组分别随机取大鼠右侧眼球6只,40 g·L-1多聚甲醛固定,梯度酒精脱水,二甲苯透明后浸蜡包埋。沿视神经矢状轴作非连续切片,切片厚度约为4 μm。RIRI后24 h,各组视网膜组织行免疫组织化学染色和TUNEL染色;RIRI后7 d,各组视网膜组织行HE染色。
  1.2.3 HE染色
  石蜡切片脱蜡至水,苏木素染核,伊红染色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光学显微镜观察并拍照。采用Cellsens 1.6图像分析软件,随机选取4点测量大鼠视网膜距视盘外200 μm 处100 μm长度内的内界膜到外丛状层内层内缘厚度,取均值作为视网膜内层厚度,并计算距视盘边缘100 μm处100 μm长度内视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)层单位面积RGC数。
  1.2.4 免疫组织化学染色
  石蜡切片脱蜡水化,抗原修复,体积分数3%H2O2阻断内源性过氧化物酶,山羊血清封闭,加入兔抗活性Caspase-3(1:75)4 ℃ 冰箱过夜;复温后使用0.01 mol·L-1 PBS冲洗,加入兔抗大鼠多克隆抗体,DAB显色,苏木素染核,酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。光学显微镜下观察并计算单位面积活性Caspase-3染色阳性细胞数。
  1.2.5 TUNEL染色检测大鼠视网膜细胞凋亡
  按照TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒说明书进行,DAB显色,苏木素染核,脱水、透明,中性树胶封片,光学显微镜下观察。每只大鼠取4~5张非连续切片,每张切片随机选取10个400倍视野,计算单位面积 TUNEL染色阳性细胞数。
  1.3 统计学处理
  采用SPSS 19.0统计学软件进行统计学分析。所有计量资料采用均数±标准差(xˉ±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,采用SNK-q检验进行组间两两比较。检验水准:α=0.05。

  2 结果

  2.1 HE染色结果
  光学显微镜下观察可见,正常对照组大鼠视网膜各层分界清楚,视网膜细胞形态正常,细胞排列紧密、规整。RIRI后7 d,与正常对照组相比,RIRI腹腔组和RIRI静脉组视网膜层次可,各层组织形态欠规则,细胞排列疏松、紊乱;视网膜内层厚度明显变薄,RGC数目明显减少,与正常对照组相比差异均具有统计学意义(均为P<0.05);RIRI腹腔组与RIRI静脉组间视网膜内层厚度、RGC数目比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。RIRI后7 d,NAS腹腔组视网膜层次较清晰,各层组织形态较规则,细胞排列较规整;NAS静脉组视网膜各层形态及细胞排列均趋于正常。NAS腹腔组、NAS静脉组较RIRI腹腔组和RIRI静脉组大鼠视网膜内层变薄程度及RGC数目减少程度均减轻,差异均具有统计学意义(均为P<0.05),且NAS静脉组变化程度均较NAS腹腔组更明显,差异均具有统计学意义(均为P<0.05);但NAS静脉组、NAS腹腔组视网膜内层厚度、RGC数目与正常对照组相比差异仍均有统计学意义(均为P<0.05)。见图1、表1。
  
  图1 RIRI后7 d,各组大鼠视网膜HE染色结果(×400) 
  A:正常对照组,视网膜各层分界清楚,视网膜细胞形态正常,细胞排列紧密、规整;B、C: RIRI腹腔组和RIRI静脉组,视网膜层次可,各层组织形态欠规则,细胞排列疏松、紊乱;D:NAS腹腔组,视网膜层次较清晰,各层组织形态较规则,细胞排列较规整;E:NAS静脉组,视网膜各层形态及细胞排列均趋于正常
  表1 各组大鼠RIRI后7 d视网膜内层厚度、RGC数目及RIRI后24 h视网膜活性Caspase-3阳性细胞数、TUNEL染色阳性细胞数比较(xˉ±s)
  
  2.2 活性Csapase-3免疫组织化学染色结果
  活性Csapase-3蛋白阳性表达为细胞核棕黄色染色,主要见于RGC层和内核层。正常对照组视网膜偶见活性Caspase-3阳性细胞。RIRI后24 h,RIRI腹腔组和RIRI静脉组视网膜可见大量的活性Caspase-3阳性细胞,与正常对照组相比,差异均有统计学意义(均为P<0.05),但2组间活性Caspase-3阳性细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05);NAS腹腔组、NAS静脉组活性Caspase-3阳性细胞数较RIRI腹腔组和RIRI静脉组均减少,且NAS静脉组活性Caspase-3阳性数显着低于NAS腹腔组,差异均有统计学意义(均为P<0.05);但NAS腹腔组、NAS静脉组活性Caspase阳性细胞数仍均高于正常对照组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见图2、表1。
  
  图2 RIRI后24 h,各组大鼠视网膜活性Caspase-3蛋白免疫组织化学染色结果(×400)
  A:正常对照组,几乎未见活性Caspase-3阳性细胞;B、C: RIRI腹腔组和RIRI静脉组,可见大量活性Caspase-3阳性细胞;D、E:NAS腹腔组和NAS静脉组,可见较少活性Caspase-3阳性细胞。箭头示活性Caspase-3阳性细胞
  2.3 TUNEL染色结果
  大鼠视网膜TUNEL染色阳性细胞表现为细胞核呈棕色,主要位于RGC层和内核层。正常对照组大鼠视网膜偶见TUNEL染色阳性细胞。RIRI后24 h,与正常对照组相比,RIRI腹腔组、RIR静脉组、NAS腹腔组、NAS静脉组TUNEL染色阳性细胞数均明显增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);RIRI腹腔组与RIRI静脉组间TUNEL染色阳性细胞数比较,差异无统计学意义(P>0.05);与RIRI腹腔组和RIRI静脉组相比,NAS腹腔组、NAS静脉组TUNEL染色阳性细胞数均明显降低,差异均具有统计学意义(均为P<0.05);与NAS腹腔组相比,NAS静脉组TUNEL染色阳性细胞数降低更明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3、表1。
  
  图3 RIRI后24 h,各组大鼠视网膜TUNEL染色结果(×400)
  A:正常对照组,偶见TUNEL染色阳性细胞;B、C: RIRI腹腔组和RIRI静脉组,可见大量TUNEL染色阳性细胞;D、E:NAS腹腔组和NAS静脉组,可见较少TUNEL染色阳性细胞。箭头示TUNEL染色阳性细胞

  3 讨论

  近年来关于RIRI的研究越来越多,特别是各种药物的治疗效果,然而目前对RIRI仍缺乏行之有效的治疗方案,RIRI的预防与治疗已成为目前眼科学研究的热点问题。NAS作为褪黑素的前体物质,经芳香胺-N-乙酰转移酶(AANAT)催化后由5-羟色胺合成,其主要表达于松果腺和视网膜中,NAS不仅在眼部疾病,在神经系统、消化系统及生殖系统等疾病上的研究也取得了很多的成就[5-7]。NAS在RIRI中主要通过抗细胞凋亡、拮抗氧自由基、干预炎症反应等途径对神经保护起着重要作用[8]。张婷婷等[3]研究表明,NAS腹腔注射可抑制RIRI后的视网膜细胞凋亡,具有神经保护作用。然而迄今为止,尚未见有研究比较不同NAS给药途径对RIRI的影响,而静脉注射可极大程度提高血药浓度,故本研究拟通过组织病理学、免疫组织化学染色和TUNEL染色法比较腹腔注射与尾静脉注射两种途径对RIRI的保护作用。
  研究发现,RIRI后7 d,大鼠视网膜形态开始出现较明显的渐进性损伤,包括视网膜厚度变薄、RGC损害等[9],故本研究选取RIRI后7 d对大鼠视网膜行HE染色,观察腹腔和静脉注射两种给药途径的NAS对RIRI大鼠视网膜组织病理形态学的影响。结果显示,RIRI后7 d,RIRI静脉组和RIRI腹腔组大鼠视网膜层次可,各层组织形态欠规则,细胞排列疏松、紊乱,视网膜内层厚度变薄、RGC数目均明显减少;NAS腹腔组、NAS静脉组大鼠视网膜层次较清晰,各层组织形态较规则,细胞排列较规整,视网膜内层厚度变薄程度、RGC数目减少程度均较RIRI静脉组和腹腔组明显减轻,且NAS静脉组大鼠各层视网膜组织形态结构、视网膜内层厚度和RGC数目均趋于正常。其中,RIRI后视网膜细胞的减少主要出现在内5层,尤其是RGC层和内核层,其中包含的主要细胞为RGC、无长突细胞、双极细胞和水平细胞,这与文献报道是一致的[10]。提示NAS静脉治疗途径能更好地减轻RIRI大鼠视网膜的病理学损伤,这可能是由于静脉注射给药可使药物直接进入血液循环,起效快,损耗小,而腹腔注射则要经过首关消除,因此会导致药物的大量损耗;另外,也可能由于静脉注射的吸收速度比腹腔注射快得多,因而静脉注射更容易达到更高的血药浓度,从而产生更强烈的反应。
  细胞凋亡在RIRI中的重要作用日益凸显,是心、脑、肠及视网膜等组织RIRI中细胞死亡的主要形式。凌士奇等[11]通过实验证实,RIRI大鼠视网膜内层细胞的凋亡征象尤以再灌注24 h时最为显着,而Caspase是细胞凋亡过程中尤为重要的蛋白酶,凋亡最后的实施是靠Caspase的激活而实现的,Caspase的激活是一种“瀑布式”的级联反应,而Caspase-3是Caspase级联反应中下行的最关键的执行蛋白酶,在各种凋亡程序中起最后枢纽的作用[12]。因此,本研究通过对RIRI后24 h的活性Caspase-3阳性细胞数及TUNEL染色阳性细胞数的观察,探讨NAS腹腔和静脉注射两种给药途径对RIRI大鼠视网膜细胞凋亡的影响。结果显示,NAS腹腔组、NAS静脉组在RIRI后24 h活性Caspase-3蛋白的表达和TUNEL染色阳性细胞数均少于RIRI腹腔组和RIRI静脉组,且NAS静脉组活性Caspase-3蛋白的表达和TUNEL染色阳性细胞数均少于NAS腹腔注射组。提示腹腔与静脉注射NAS均可不同程度地减轻RIRI大鼠视网膜细胞的凋亡,发挥神经保护作用,且NAS静脉注射的疗效优于NAS腹腔注射。
  总之,静脉与腹腔注射NAS均可减少RIRI后视网膜细胞的凋亡,从而减轻RIRI大鼠视网膜损伤,且静脉给药较腹腔给药疗效更为显着。本研究为NAS治疗RIRI的最佳途径选择提供了一定的理论依据。

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