巨噬细胞β-arrestin-1对动脉粥样硬化的作用机制研究

医学论文 2021-09-17 08:34166未知xhm
摘    要:目的:探究巨噬细胞β-arrestin-1对动脉粥样硬化的作用机制。方法:选取实验小鼠,建立动脉粥样硬化小鼠模型,观察巨噬细胞β-arrestin-1的作用机制。结果:β-arrestin-1蛋白表达后,小鼠动脉粥样硬化程度更加严重,主动脉整体斑块面积增加。主动脉根部斑块面积增加,斑块的不稳定性增加。PNU282987激动α7nAChR后,动脉粥样硬化更加严重,主动脉整体斑块面积明显减少。并且斑块的稳定性增加,主动脉根部粥样斑块面积减少。对于多发性硬化小鼠模型,脊髓小胶质细胞β-arrestin-1明显增加。β-arrestin-1蛋白表达后,很大程度抑制了激动a7nAChR的作用。β-arrestin-1蛋白表达,影响PNU282987激动α7nAChR抑制NLRP3炎性小体作用。结论:巨噬细胞β-arrestin-1有抗动脉粥样硬化作用,并且介导α7nAChR,发挥抗动脉粥样硬化的作用。
关键词:巨噬细胞 β-arrestin-1 动脉粥样硬化 多发性硬化 作用机制

动脉粥样硬化是危害人类健康的重要疾病之一,动脉粥样硬化的病理基础是由于内皮细胞损伤,在动脉内膜下聚集白细胞,异常增殖平滑肌细胞,脂质被吞噬,脂质条纹产生[1]。单核-巨噬细胞在动脉粥样硬化的发生发展中发挥重要作用。动脉内膜受损后,动脉内膜下层聚集单核细胞,转变为巨噬细胞,进而转变为泡沫细胞。β-arrestin-1和β-arrestin-2为β-arrestin的两个蛋白,属于胞浆调节蛋白家族。β-arrestin蛋白对于动脉粥样硬化、心肌梗死、脑梗死等多种疾病的发生发展发挥重要作用[2]。为探索β-arrestin-1对动脉粥样硬化的作用机制,现报告如下。

资料与方法

本次研究选取实验动物小鼠,饲养繁殖的环境为恒定的温度和湿度,70%的相对湿度,22℃的温度;8:00-20:00为光照时间;正常自由饮水饮食。
方法:(1)髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除小鼠的培育:培育操作使用Cre-Lox P重组酶系统。Cre重组酶可以对Lox P标记的两端位点进行识别。标记基因位点的探针为Lox P。Cre重组酶可以特异性识别,抑制表达标记位点间的基因序列。含有Lox P的小鼠,与含有Cre重组酶的小鼠杂交,从而培育符合条件的敲除小鼠。交配后,获得野生型小鼠、特异性β-arrestin-1敲除小鼠。(2)髓系(巨噬细胞)特异性β-arrestin-1敲除小鼠的鉴定:对小鼠的Lox P基因、Cre基因进行鉴定。提取小鼠尾巴的DNA,进行扩增,扩增完成后,将4μL的6×loading buffer加入到每个样品中。读取分析Cre小鼠电泳结果,在324 bp处出现一条明亮的条带,在500 bp处Cre阳性小鼠出现一条条带,Cre阴性小鼠没有。读取分析Lox P小鼠电泳结果,336 bp、457 bp条带为杂合子,36 bp条带为野生型,457bp条带为纯合子。(3)构建动脉粥样硬化小鼠模型:取Apo E-/-小鼠,均为8周龄。喂养4个月,使用高脂饲料。配方包括:1.9 g/100 g麦芽糊精,1.6 g/100 g预混料,胆盐0.3 g/100 g,胆固醇1.3 g/100 g,8.5酪蛋白,蔗糖10 g/100 g,16.4 g/100 g猪油,60 g/100 g繁殖鼠料。构建动脉粥样硬化小鼠模型。
观察指标:观察β-arrestin-1抗动脉粥样硬化作用,分析小鼠主动脉整体斑块、主动脉根部斑块及血脂水平。观察β-arrestin-1介导α7n ACh R发挥作用。
统计学处理:数据应用SPSS 20.0软件处理;计量资料以表示,采用t检验;P<0.05为差异有统计学意义。

结果

β-arrestin-1抗动脉粥样硬化作用:(1)增加主动脉整体斑块面积:取出野生型小鼠、β-arrestin-1敲除小鼠的骨髓细胞,制成细胞悬液。在Apo E-/-小鼠体内,移植入细胞悬液。经过8周骨髓重建,以及抗生素喂养。然后喂养高脂饮食4个月,形成动脉粥样硬化小鼠模型。完整取出小鼠的主动脉,剥离主动脉附着的软组织,进行油红O染色。结果显示,β-arrestin-1蛋白表达后,小鼠动脉粥样硬化程度更加严重。(2)增加主动脉根部斑块面积、降低斑块稳定性:病理检测主动脉根部的斑块,进一步分析β-arrestin-1对动脉粥样硬化的作用。取出心脏组织,带有主动脉头端,垂直切开,包埋剂中固定带有主动脉头端的部分。然后切片,获得冰冻切片,带有主动脉根部。粥样斑块面积采用油红O染色检测。粥样斑块的稳定性用天狼星红染色法、Masson三色法、免疫组织化学染色法进行检测。主动脉根部斑块面积增加,胶原成分所占面积比例降低,粥样斑块坏死区域面积比例增加,巨噬细胞数量及比例增加,斑块的不稳定性增加。表示在动脉粥样硬化机体中,β-arrestin-1发挥保护作用。见表1。
表1 两组小鼠血脂水平情况

β-arrestin-1介导α7n ACh R的抗动脉粥样硬化作用:(1)降低主动脉整体斑块面积作用:将实验小鼠分为四组,Apo E-/-β-arrestin-1fl/fl Lys Mcre、Apo E-/-β-arrestin-1fl/fl、Apo E-/-β-arrestin-1fl/fl Lys McrePNU282987、Apo E-/-β-arrestin-1fl/fl PNU282987。喂养高脂饮食的最后一个月,小鼠腹腔注射PNU282987,每日注射1 mg/kg。完整取出主动脉进行研究,剥离结缔组织,采用油红O染色。结果显示,PNU282987激动α7n ACh R后,动脉粥样硬化更加严重,主动脉整体斑块面积明显减少。β-arrestin-1蛋白表达后,有抑制抗主动脉斑块形成的作用。反映了β-arrestin-1的介导,对α7n ACh R的抗主动脉斑块形成有决定性作用。(2)降低主动脉根部斑块面积,提高斑块稳定性:病理检测主动脉根部斑块。获取主动脉根部的冰冻切片。粥样斑块的稳定性用天狼星红染色法、Masson三色法、免疫组织化学染色法进行检测。粥样斑块面积采用油红O染色检测。结果显示,斑块的不稳定性降低,胶原成分所占面积比例增加,粥样斑块的坏死区域面积比例减少,巨噬细胞数量及比例减少,主动脉根部斑块面积减少。反映了激动α7n ACh R,使斑块的稳定性增加。β-arrestin-1蛋白表达后,很大程度抑制了激动a7n ACh R的作用。说明了β-arrestin-1介导的主要作用。(3)降血脂作用:留取模型小鼠的血液,采取眼球取血的方式,检测相关血脂指标。结果显示,PNU282987激动α7n ACh R后,高密度脂蛋白增加,低密度脂蛋白、甘油三酯、总胆固醇下降。说明了激动α7n ACh R,发挥降血脂的作用。β-arrestin-1蛋白表达后,抑制了激动α7n ACh R的这种作用,但没有影响对降低甘油三酯的作用。说明了β-arrestin-1介导的决定性作用。见表2。
表2 四组小鼠血脂水平情况

讨论

β-arrestins蛋白是一类胞内的调节性蛋白质,调节多种受体的转运,在视锥细胞、视杆细胞的arrestin4和arrestin1中存在。β-arrestins类蛋白主要分为β-arrestin-1、β-arrestin-2蛋白。β-arrestins蛋白调控最多的是七次跨膜受体。但近年来研究发现,在其他多种细胞内信号通路中,不依赖激活G蛋白偶联受体,β-arrestins蛋白发挥关键的调控作用[3]。因此,提出β-arrestins蛋白的开发利用,从而开发新药,促进疾病的治疗。本次研究中显示,动脉粥样硬化小鼠的主动脉β-arrestin-1,相比正常小鼠,明显增加,在动脉粥样硬化的发生发展中,巨噬细胞β-arrestin-1发挥重要的作用。特异性敲除β-arrestin-1,斑块的不稳定增加,斑块面积增加。
目前大量研究表明,在多种疾病中,α7n ACh R发挥着重要的机体保护作用,且具有抗炎作用。由于介导的抗炎作用,发挥激动α7n ACh R的抗动脉粥样硬化作用[4-5]。本次研究显示,PNU 282987激动α7n ACh R后,增加斑块稳定性,降低主动脉根部的斑块面积及主动脉整体斑块面积,疾病严重程度降低。说明α7n ACh R的保护作用,有β-arrestin-1参与介导,为抗动脉粥样硬化药物的研发提供新方向。BV2细胞由LPS/ATP刺激,NLRP3炎性小体激活作用,被激动α7n ACh R抑制。β-arrestin-1蛋白对激动α7n ACh R的抗炎作用出现极大的抑制。并且,NLRP3蛋白与β-arrestin-1蛋白结合,也受到激动α7n ACh R的抑制。
综上所述,巨噬细胞β-arrestin-1有抗动脉粥样硬化作用,并且介导α7n ACh R,发挥抗动脉粥样硬化的作用。

参考文献
[1]刘琴,杨黎星,石婧,等.小檗碱激活巨噬细胞自噬并改善动脉粥样硬化斑块脆弱性[J].基础医学与临床,2020,40(5):668-677.
[2]王波,余珊,俞华,等.熊果酸抑制动脉粥样硬化巨噬细胞吞噬脂质作用[J].中国老年学杂志,2019,39(24):6060-6062.
[3]毕颖超,鲜雪梅,王珍珍,等.血红素氧化酶1调控巨噬细胞极化对动脉粥样硬化的影响[J].徐州医科大学学报,2020,40(4):255-260.
[4]陈萍,陈文娜.丹参酮ⅡA通过调控巨噬细胞极化抗动脉粥样硬化的机制研究[J].辽宁医学杂志,2019,33(6):70-74.
[5]孙小淋,鲁敏,楚英杰.巨噬细胞的异质性与动脉粥样硬化[J].中华心血管病杂志,2019,47(8):660-663.

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