LINC00473调控miR-210/TET2分子轴对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞生物学特性的影响

医学论文 2020-07-21 08:1163未知xhm
  摘要:目的 探讨LINC00473调控miR-210/10-11易位酶2(TET2)分子轴对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞生物学特性的影响。方法 人晶状体上皮细胞SRA01/04传代培养后,采用100μmol·L-1 H2O2处理24 h。将SRA01/04细胞分为Con组、H2O2组、H2O2+pcDNA3.1组、H2O2+pcDNA3.1-LINC00473组、H2O2+pcDNA3.1-LINC00473+miR-NC组、pcDNA3.1-LINC00473+miR-210组、H2O2+pcDNA3.1-LINC00473+si-NC组、H2O2+pcDNA3.1-LINC00473+si-TET2组。细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷光甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。双荧光素酶报告基因实验检测LINC00473与miR-210、miR-210与TET2的靶向结合关系。结果 Con组与H2O2组、H2O2+pcDNA3.1组与H2O2+pcDNA3.1-LINC00473组、H2O2+pcDNA3.1-LINC00473+miR-NC组与pcDNA3.1-LINC00473+miR-210组、H2O2+pcDNA3.1-LINC00473+si-NC组与H2O2+pcDNA3.1-LINC00473+si-TET2组相比,细胞存活率、细胞凋亡率、克隆形成数、MDA含量、SOD和GSH-Px活性差异均有统计学意义(均为P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-NC和WT-LINC00473共转染组SRA01/04细胞荧光素酶活性(0.36±0.03)较miR-210 mimics和WT-LINC00473共转染组(0.96±0.10)显着降低(P<0.05);miR-NC和WT-TET2共转染组SRA01/04细胞的荧光素酶活性(0.33±0.03)较miR-210 mimics和WT-TET2共转染组(0.94±0.09)显着降低,差异有统计学意义(P<0.05);LINC00473靶向作用miR-210并下调其表达水平,miR-210可负调控TET2的表达水平。结论 LINC00473通过下调miR-210/TET2分子轴减轻对H2O2对人晶状体上皮细胞增殖、凋亡和氧化损伤的影响。
  关键词:LINC00473 miR-210 TET2 过氧化氢 晶状体上皮细胞 增殖 凋亡 氧化应激

  白内障会降低老年人生活质量,给患者带来巨大的经济和精神负担,已成为全球重大的公共卫生问题[1]。既往研究显示,人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,hLECs)凋亡是白内障发生的病理基础,而氧化应激损伤是导致hLECs凋亡的主要危险因素[2]。探讨hLECs增殖、凋亡和氧化应激损伤的分子机制对防治白内障意义重大。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸且无蛋白编码潜能的RNA转录本。最近研究表明,lncRNA参与细胞增殖、凋亡、氧化应激损伤等多种病理生理过程,在眼部正常发育中起着重要作用[3-4]。LINC00473是位于染色体6q27位点的基因间lncRNA,其参与宫颈癌[5]、胰腺癌[6]等多种肿瘤细胞生长、存活的调控,沉默LINC00473可抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡。此外,LINC00473还可调控滋养细胞的增殖和凋亡,与子痫前期的发生发展有关[7]。然而,目前未见LINC00473与hLECs的相关报道。H2O2可诱导hLECs氧化应激损伤和凋亡,是研究白内障常用的体外细胞模型的建立方法[8-9]。因此,本研究通过检测LINC00473在H2O2诱导的hLECs中的表达水平,初步揭示其调控细胞增殖、凋亡以及氧化应激损伤的分子机制,以期为基于hLECs防治白内障提供新的方法。

  1 材料与方法

  1.1 实验材料
  hLECs SRA01/04细胞购于上海拜力生物科技有限公司;DMEM低糖培养基、胎牛血清和青霉素、链霉素溶液购于美国Hyclone公司;H2O2购于美国Sigma公司;LipofectamineTM 2000、TRIzol试剂购于美国Invitrogen公司;兔抗半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、P21、10-11易位酶2(ten-eleven trantranslocation 2,TET2)抗体以及山羊抗兔IgG购于美国Abcam公司;pcDNA3.1-LINC00473、pcDNA3.1、si-NC、si-LINC00473、si-TET2、miR-NC、miR-210mimics、anti-miR-NC、anti-miR-210、WT-LINC00473、MUT-LINC00473、WT-TET2、MUT-TET2由上海吉玛制药公司提供;cDNA合成试剂盒、SYBR Green Realtime PCR试剂盒购于日本Toyobo公司;细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)购于上海贝博生物;丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)以及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase,GSH-Px)活性检测试剂盒购于北京索莱宝科技公司。
  1.2 细胞培养和模型构建
  SRA01/04细胞采用DMEM低糖培养基(含体积分数10%胎牛血清和10 g·L-1青-链霉素)在37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱内培养。当细胞融合度达90%时消化传代。细胞培养液内加入100 μmol·L-1 H2O2后于培养箱内培养24 h,建立H2O2细胞损伤模型。
  1.3 细胞分组处理
  将SRA01/04细胞按照每孔200×103个细胞接种于6孔板,当细胞融合度达到50%时按照脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000说明书将pcDNA3.1-LINC00473、pcDNA3.1分别转染至SRA01/04细胞,经H2O2诱导后,依次标记为H2O2+pcDNA3.1-LINC00473组、H2O2+pcDNA3.1组。同时设置Con组(正常对照组)、H2O2组(仅建立H2O2细胞损伤模型)。
  1.4 实验方法
  收集细胞,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况, CCK-8法检测各组细胞存活率,严格按照试剂盒说明书步骤检测各组细胞中MDA含量以及SOD、GSH-Px活性。 同时进行以下实验。
  1.4.1 集落形成实验
  将对数生长期的各组细胞按照每孔200个接种于6孔板,米字型方向轻轻晃动平板使细胞分散均匀,培养7 d后观察细胞生长情况,当出现肉眼可见的细胞克隆时终止培养,弃去细胞培养基,固定和染色后,显微镜下观察拍照,计算克隆形成数。实验重复3次。
  1.4.2 RT-qPCR检测
  利用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA,以cDNA第一链合成试剂盒逆转录合成cDNA,利用SYBR Green Realtime PCR试剂盒进行PCR扩增。以GAPDH为内源性参照,运用2-ΔΔCt法分析LINC00473的表达水平。引物序列为:LINC00473上游引物:5’-GATGGAAAGGAGGGAAGG-3’,下游引物:5’-CACAGTGGGTCCAGGGTT-3’;GAPDH上游引物:5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’,下游引物:5’-GATGGCAACAATATCCACTT-3’。
  1.4.3 Western blot检测
  收集各组细胞获得细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度后,按照每泳道 40 μg 蛋白样品上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,采用湿法转膜将已分离的细胞蛋白转移至硝酸纤维素膜,洗膜后,将膜置于50 g·L-1脱脂牛奶中封闭1 h,洗膜后将膜置于稀释的一抗(Caspase-3为1:500,P21为1:1000,TET2为1:250)溶液中室温孵育2 h,洗膜后,将膜置于稀释的二抗(1:2000)溶液中室温孵育1 h。加入化学发光试剂避光显色后,Quantity One软件分析蛋白表达水平。
  1.4.4 双荧光素酶报告基因实验
  等线生物信息学分析工具starBase进行靶基因预测,发现LINC00473与miR-210之间存在结合位点,targetscan进行靶基因预测,发现miR-210与TET2之间存在结合位点,采用双荧光素酶报告基因实验验证LINC00473与miR-210、miR-210与TET2靶向调控关系。将WT-LINC00473、MUT-LINC00473、WT-TET2、MUT-TET2分别与miR-NC、miR-210 mimics共转染至SRA01/04细胞,转染48 h后,测定各组细胞荧光素酶活性。同时将pcDNA3.1、pcDNA3.1-LINC00473、si-NC、si-LINC00473分别转染hLECs SRA01/04细胞,以U6为内参, 参照1.4.2方法检测miR-210的表达水平。将miR-NC、miR-210 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-210分别转染SRA01/04细胞,以GAPDH为内参,参照1.4.2方法检测TET2的表达水平。引物序列为:miR-210上游引物:5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’,下游引物:5’-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3’;U6上游引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’;TET2上游引物:5’-TAAGTGGGTGGTTCGCAGA-3’,下游引物:5’-TCCGAGTAGAGTTTGTCAGCC-3’。
  1.4.5 LINC00473调控miR-210/TET2分子轴影响H2O2诱导的hLECs增殖、凋亡以及氧化应激损伤
  为验证LINC00473是否通过调控miR-210/TET2分子轴进而影响H2O2诱导的hLECs增殖、凋亡以及氧化应激损伤,将pcDNA3.1-LINC00473+miR-NC、pcDNA3.1-LINC00473+miR-210、pcDNA3.1-LINC00473+si-NC、pcDNA3.1-LINC00473+si-TET2分别转染SRA01/04细胞,经H2O2诱导后,再次检测细胞存活率、凋亡率、克隆形成数、MDA含量以及SOD和GSH-Px活性。
  1.5 统计学分析
  采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析,所有结果均采用xˉ±s表示。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,进一步组间比较采用SNK-q检验。检验水准:α=0.05。

  2 结果

  2.1 LINC00473对H2O2诱导的SRA01/04细胞的影响
  与Con组比较,H2O2组SRA01/04细胞LINC00473的表达水平显着降低,Caspase-3和P21蛋白的表达显着升高,细胞克隆形成数显着减少,细胞存活率显着降低,细胞凋亡率显着升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与H2O2+pcDNA3.1组比较,H2O2+pcDNA3.1-LINC00473组SRA01/04细胞LINC00473的表达水平显着升高,Caspase-3和P21蛋白的表达显着降低,细胞克隆形成数显着增加,细胞存活率显着升高,细胞凋亡率显着降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。与Con组比较,H2O2组SRA01/04细胞中SOD和GSH-Px活性均显着降低,MDA含量显着升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与H2O2+pcDNA3.1组比较,H2O2+ pcDNA3.1-LINC00473组SRA01/04细胞中SOD和GSH-Px活性均显着升高,MDA含量显着降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见表1和表2。
  2.2 LINC00473靶向调控miR-210
  starBase预测发现,LINC00473与miR-210之间存在部分连续互补的核苷酸序列,见图1。双荧光素酶报告实验结果显示,miR-NC和WT-LINC00473共转染组SRA01/04细胞荧光素酶活性(0.36±0.03)较miR-210 mimics和WT-LINC00473共转染组(0.96±0.10)显着降低(P<0.05);miR-NC和MUT-LINC00473共转染组SRA01/04细胞荧光素酶活性(1.04±0.10)与miR-210 mimics和MUT-LINC00473共转染组(0.99±0.10)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。RT-qPCR检测结果显示,上调LINC00473表达后,SRA01/04细胞miR-210的表达水平(0.23±0.02)较正常SRA01/04细胞(1.00±0.10)显着降低(P<0.05);干扰LINC00473表达后,SRA01/04细胞miR-210的表达水平(2.11±0.22)较正常SRA01/04细胞显着升高(P<0.05)。以上结果表明,LINC00473靶向负调控miR-210表达。
  表1 各组细胞中LINC00473的表达及Caspase-3和P21蛋白表达情况
  
  表2 LINC00473对H2O2诱导的SRA01/04细胞增殖、凋亡及SOD、GSH-Px、MDA表达的影响
  
  
  图1 LINC00473靶向miR-210
  2.3 过表达miR-210逆转LINC00473对H2O2诱导的SRA01/04细胞增殖、凋亡及氧化损伤的影响
  与H2O2+ pcDNA3.1-LINC00473+ miR-NC组SRA01/04细胞中miR-210(1.01±0.10)、Caspase-3蛋白(0.31±0.03)和P21蛋白(0.38±0.04)表达比较,H2O2+ pcDNA3.1-LINC00473+ miR-210组SRA01/04细胞miR-210(1.89±0.17)、Caspase-3蛋白(0.66±0.07)和P21蛋白(0.79±0.08)的表达水平均显着升高。与H2O2+pcDNA3.1-LINC00473+miR-NC组相比,H2O2+pcDNA3.1-LINC00473+miR-210组的细胞克隆形成数显着减少,细胞存活率显着降低,细胞凋亡率显着升高,SOD和GSH-Px活性均显着降低,MDA含量显着升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见表3。
  表3 过表达miR-210及抑制TET2对SRA01/04细胞增殖、凋亡及SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响
  
  2.4 miR-210靶向调控TET2
  miR-210与TET2之间存在部分连续互补的核苷酸序列,见图2。双荧光素酶报告实验结果显示,miR-NC和WT-TET2共转染组SRA01/04细胞荧光素酶活性(0.33±0.03)较miR-210 mimics和WT-TET2共转染组(0.94±0.09)显着降低,差异有统计学意义(P<0.05);miR-NC和MUT-TET2共转染组SRA01/04细胞荧光素酶活性(1.00±0.10)较miR-210 mimics和MUT-TET2共转染组(0.96±0.09)变化不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。RT-qPCR和Western blot检测结果显示,上调miR-210表达后,SRA01/04细胞TET2 mRNA(0.34±0.03)和蛋白(0.20±0.02)的表达水平均较正常SRA01/04细胞TET2 mRNA(1.01±0.10)和蛋白(0.61±0.06)的表达水平显着降低;下调miR-210表达后,SRA01/04细胞TET2 mRNA(1.88±0.18)和蛋白(1.45±0.15)的表达水平均较正常SRA01/04细胞显着升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。提示miR-210靶向负调控TET2表达。
  
  图2 miR-210靶向TET2
  2.5 抑制TET2逆转LINC00473对H2O2诱导的SRA01/04细胞增殖、凋亡及氧化损伤的影响
  与H2O2+ pcDNA3.1-LINC00473+ si-NC组TET2质粒(0.88±0.08)、Caspase-3蛋白(0.29±0.03)、P21蛋白(0.37±0.03)表达比较,H2O2+ pcDNA3.1-LINC00473+ si-TET2组SRA01/04细胞TET2质粒(0.24±0.02)表达显着降低,Caspase-3蛋白(0.72±0.07)和P21蛋白(0.85±0.08)表达均显着升高。与H2O2+ pcDNA3.1-LINC00473+ si-NC组相比,H2O2+ pcDNA3.1-LINC00473+ si-TET2组细胞克隆形成数显着减少,细胞存活率显着降低,细胞凋亡率显着升高,SOD和GSH-Px活性显着降低,MDA含量显着升高(均为P<0.05),见表3。


  3 讨论

  白内障是全球致盲的主要眼病之一,全球约50%的失明患者是由白内障引起的[10]。晶状体是由单层上皮细胞构成的透明器官,氧化应激引起的hLECs损伤和凋亡是引发白内障的主要原因。本研究通过H2O2诱导hLECs氧化应激损伤和凋亡,探索与其相关的基因,以期为基于hLECs防治白内障提供新的方法。
  LINC00473是乳腺癌预后的独立影响因素,其高表达与乳腺癌患者的淋巴结转移、临床分期及预后较差有关,抑制LINC00473表达可抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡[11]。LINC00473在胶质瘤中表达上调,干扰LINC00473可抑制胶质瘤细胞的增殖和肿瘤生长,抑制胶质瘤进展[12]。本研究结果表明,H2O2诱导后SRA01/04细胞存活率和克隆形成能力均显着降低,P21的表达显着升高,LINC00473的表达水平显着降低;上调LINC00473表达后,SRA01/04细胞存活率和克隆形成能力均显着升高,说明上调LINC00473表达可提高SRA01/04细胞的增殖能力。正常机体内存在SOD、GSH-Px等抗氧化酶防御系统,可清除自由基,保护机体免受氧化应激损伤,维持机体正常代谢活动。本研究结果显示,H2O2诱导后SRA01/04细胞脂质过氧化产物MDA含量显着升高,SOD、GSH-Px的活性显着降低,而上调LINC00473可显着降低MDA含量,提高SOD和GSH-Px活性。因此,LINC00473可抑制H2O2诱导的SRA01/04细胞氧化应激损伤。同时本研究结果显示,H2O2诱导后SRA01/04细胞中Caspase-3的表达水平显着升高,细胞凋亡率显着增加,而上调LINC00473可抑制H2O2诱导的细胞凋亡。以上结果表明,上调LINC00473可促进细胞增殖,抑制H2O2诱导的氧化应激损伤和凋亡,进而对SRA01/04细胞发挥保护作用。
  有研究表明,miRNA异常表达与晶状体发育、LECs的凋亡、晶状体透明度降低以及白内障的发生关系密切[13]。为探讨LINC00473对SRA01/04细胞的保护作用机制,本研究通过序列分析发现,miR-210是LINC00473的潜在功能性靶基因之一。miR-210在hLECs氧化损伤中表达上调,且其在年龄相关性白内障患者晶状体组织中亦是高表达,miR-210高表达可促进LECs凋亡[14-15]。本研究通过双荧光素酶报告基因实验证实,LINC00473靶向负性调控miR-210表达,过表达miR-210可逆转LINC00473对H2O2诱导的SRA01/04细胞增殖、凋亡以及SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响。
  TET2是TET蛋白家族成员之一。有研究显示,TET2参与病理条件下神经元细胞存活过程,上调TET2对氧化应激介导的神经元损伤的细胞保护作用[16]。本研究通过双荧光素酶报告基因实验证实miR-210可靶向负性调控TET2表达,进一步研究显示,抑制TET2表达能逆转LINC00473对H2O2诱导的SRA01/04细胞增殖、凋亡及SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响。提示LINC00473通过调控miR-210/ TET2分子轴可减轻H2O2诱导的hLECs氧化应激损伤和凋亡。
  综上所述,LINC00473在H2O2诱导的hLECs中表达下调,上调LINC00473表达通过调控miR-210/TET2分子轴可促进细胞增殖,抑制H2O2诱导的氧化应激损伤和凋亡,进而对hLECs发挥保护作用,为基于hLECs防治白内障提供了新的方向。

  参考文献
  [1] SHI Z,SU Y,WANG F,LIU P.Downregulation of microRNA-181a attenuates hydrogen peroxide-induced human lens epithelial cell apoptosis in vitro[J].Mol Med Rep,2018,17(4):6009-6015.
  [2] FENG K,GUO H K.Eaf2 protects human lens epithelial cells against oxidative stress-induced apoptosis by Wnt signaling[J].Mol Med Rep,2018,17(2):2795-2802.
  [3] XU X D,LI K R,LI X M,JIN Y,QIN J,YAN B.Long non-coding RNAs:new players in ocular neovascularization[J].Mol Biol Rep,2014,41(7):4493-505.
  [4] SHEN Y,DONG L F,ZHOU R M,YAO J,SONG Y C,YANG H,et al.Role of long non-coding RNA MIAT in proliferation,apoptosis and migration of lens epithelial cells:a clinical and in vitro study[J].J Cell Mol Med,2016,20(3):537-548.
  [5] SHI C,YANG Y,YU J,MENG F,ZHANG T,GAO Y.The long noncoding RNA LINC00473,a target of microRNA 34a,promotes tumorigenesis by inhibiting ILF2 degradation in cervical cancer[J].Am J Cancer Res,2017,7(11):2157-2168.
  [6] ZHOU W Y,ZHANG M M,LIU C,KANG Y,WANG J O,YANG X H.Long noncoding RNA LINC00473 drives the progression of pancreatic cancer via upregulating programmed death-ligand 1 by sponging microRNA-195-5p[J].J Cell Physiol,2019,234(12):23176-23189.
  [7] WU D,XU Y,ZOU Y,ZUO Q,HUANG S,WANG S,et al.Long noncoding RNA 00473 is involved in preeclampsia by LSD1 binding-regulated TFPI2 transcription in trophoblast cells[J].Mol Ther Nucleic Acids,2018,12:381-392.
  [8] BAI J,ZHENG Y,DONG L,CAI X,WANG G,LIU P.Inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase phosphorylation decreases H2O2-induced apoptosis in human lens epithelial cells[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2015,253(11):1933-1940.
  [9] MOK J W,CHANG D J,JOO C K.Antiapoptotic effects of anthocyanin from the seed coat of black soybean against oxidative damage of human lens epithelial cell induced by H2O2[J].Curr Eye Res,2014,39(11):1090-1098.
  [10] PASCOLINI D,MARIOTTI S P.Global estimates of visual impairment:2010[J].Br J Ophthalmol,2012,96(5):614-618.
  [11] BAI J,ZHAO W Y,LI W J,YING Z W,JIANG D Q.Long noncoding RNA LINC00473 indicates a poor prognosis of breast cancer and accelerates tumor carcinogenesis by competing endogenous sponging miR-497[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2019,23(8):3410-3420.
  [12] ZHANG Q,WANG G,XU L,YAO Z,SONG L.Long non-coding RNA LINC00473 promotes glioma cells proliferation and invasion by impairing miR-637/CDK6 axis[J].Artif Cells Nanomed Biotechnol,2019,47(1):3896-3903.
  [13] 曹佳,严瑾,郜振彦,花静,颜崇淮.姜黄素对铅氧化损伤大鼠的保护作用[J].中华实用儿科临床杂志,2019,34(12):942-945.CAO J,YAN J,ZHEN Z Y,HUA J,YAN C H.Protective effect of curcumin on lead oxidative injury in rats [J].J Chin Appl Clin Pediat,2019,34(12):942-945.
  [14] 王位,马续祥,陈卫东.环黄芪醇对庆大霉素诱导小鼠急性肾损伤的保护作用[J].新乡医学院学报,2019,36(8):715-719.WANG W,MA X X,CHEN W D.Protective effect of cycloastragenol on acute kidney injury induced by gentamicin in mice [J].J Xinxiang Med Univ,2019,36(8):715-719.
  [15] LU B,CHRISTENSEN I T,MA L W,WANG X L,JIANG L F,WANG C X,et al.miR-24-p53 pathway evoked by oxidative stress promotes lens epithelial cell apoptosis in age-related cataracts[J].Mol Med Rep,2018,17(4):5021-5028.
  [16] 谭钢,吴安花,邵毅,吴恺,邹雪香,周颖.miR-210靶向沉默Bcl-2诱导人晶状体上皮细胞凋亡[J].眼科新进展,2016,36(8):701-704,708.TAN G,WU A H,SHAO Y,WU K,ZOU X X,ZHOU Y.miR-210 targeted silence Bcl-2 induces apoptosis of human lens epithelial cells [J].Rec Adv Ophthalmol,2016,36(8):701-704,708.

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